Molecular Mechanism of Tiger Bone Treatment for Osteoporosis Based on NetworkY5m知览论文网
Pharmacology AnalysisY5m知览论文网
LIANG ShuangY5m知览论文网
PAN YingY5m知览论文网
The Third Hospital of Hebei Medical University
Y5m知览论文网 Abstract：Objective: To predict the target of tiger bone for osteoporosis (OP) and explore the molecular mechanism of osteoporosis. Methods: Review the literature, retrieve the chemical composition and action targets of tiger bone, and retrieve osteoporosis-related genes using GeneCards and NCBI and other databases. Analytical enrichment was performed using the GO database and the KEGG database, and the traditional Chinese medicine-component-disease-pathway-target network map was drawn using Cytoscape 3.8.0, and the key targets were validated with molecular docking. Results: The component-target relationship network includes 19 components and 168 targets, including the key targets, PTGS2, EGFR, etc. The GO functional enrichment analysis included 1,259 biological processes, 147 associated with molecular function, and 80 associated with cell fractions. Through the enrichment and screening of the KEGG signaling pathway, 26 signaling pathways were obtained. Molecular docking results indicate that both the predicted active material components and key targets have good binding activity. Conclusion: Active components such as amino acids in tiger bone mainly regulate PTGS2 and EGFR. This study reflects the functional characteristics of "multi-component, multi-target and multipathway" of tiger bone.Y5m知览论文网 Y5m知览论文网 Keyword：tiger bone; osteoporosis; target; signaling pathway; network pharmacology;Y5m知览论文网 Y5m知览论文网
骨质疏松症(OP)是一种常见的系统性全身代谢疾病。其主要特征是骨组织结构逐渐破坏，骨脆性的增加和易于发生骨折。随着老龄化社会的进展，骨质疏松症发病率有逐年递增的趋势，这不仅造成老年人的生活质量下降，而且由此引发的各种社会经济负担也在大幅增加[1]。虎骨是猫科动物虎Panthera tigris L.的骨头，具有强身健骨、祛风除湿、消炎止痛的作用。以虎骨为主要成分的药酒、药膏、药丸对风湿有显著疗效。现代医学认为，虎骨具有镇痛、抗炎、增加免疫力和促进骨折愈合的作用[2]。Y5m知览论文网 Y5m知览论文网
长久以来，作为中医健骨的药物，虎骨的主要活性成分及分子作用机制尚不明确。本文运用生物信息学的研究方法，系统分析了虎骨治疗骨质疏松症的可能活性成分和潜在分子相互作用机制[3]，为进一步探索虎骨治疗骨质疏松症的药效-物质基础及分子机制提供依据。Y5m知览论文网 Y5m知览论文网
1 材料与方法Y5m知览论文网
1.1 虎骨活性化合物成分的筛选Y5m知览论文网
骨胶原蛋白是虎骨的主要有机成分。虎骨胶原蛋白的主要成分是部分水解的胶原蛋白，氨基酸是蛋白质的基本成分，从文献查找虎骨的氨基酸化学成分[4,5,6]，通过Pubchem数据库获得虎骨氨基酸成分的SMILE号，并进一步通过Swisstargets数据库得到化合物的预测靶点。Y5m知览论文网 Y5m知览论文网
1.2 疾病靶点的收集Y5m知览论文网
以“osteoporosis”作为关键词，在GeneCards和NCBI数据库中检索人类基因。在合并并删除相同基因后，获得骨质疏松症相关基因。Y5m知览论文网 Y5m知览论文网
1.3 蛋白质相互作用(PPI)网络的构建Y5m知览论文网
将检索到的虎骨活性化合物的可能靶点与获得的骨质疏松症疾病靶点取交集，得到虎骨治疗骨质疏松症的潜在靶点。将上述靶点导入String数据库，并设置“Homo sapiens”，得到其蛋白质-蛋白质相互作用关系。PPI网络图通过Cytoscape软件绘制。拓扑分析采用 NetworkAnalyzer工具进行，筛选得分大于平均值的基因作为关键目标。Y5m知览论文网 Y5m知览论文网
1.4 GO富集分析和KEGG通路富集分析Y5m知览论文网
将上步得到的虎骨治疗骨质疏松症的潜在靶点进行GO的分子功能(MF)、细胞成分(CC)、生物过程(BP)丰富聚集以及KEGG通路富集分析。利用String数据库，筛选P值≤0.05的项目。直方图的绘制是通过R 3.6.3软件安装并参照cluster Profiiler、enrichplot、gggplot2软件包来进行的。Y5m知览论文网 Y5m知览论文网
1.5 分子对接验证Y5m知览论文网
1.5.1 配体处理Y5m知览论文网
从Pubchem 数据库下载化合物SDF结构，用OpenBabel2.4.1将其转化为mol2格式，使用AutodockTools1.5.6设置可旋转键后，将其保存为pdbqt文件。Y5m知览论文网 Y5m知览论文网
1.5.2 受体处理Y5m知览论文网
蛋白质的三维空间结构从RCSB数据库进行下载，作为对接的蛋白质。采用Autodock tools 1.5.6在加氢、计算电荷并合并非极性氢后，将其保存为pdbqt文件。Y5m知览论文网 Y5m知览论文网
1.5.3 对接Y5m知览论文网
使用Autodock Vina 1.1.2进行对接模拟。Y5m知览论文网 Y5m知览论文网
1.6 中药-成分-疾病-通路-靶点网络的绘制Y5m知览论文网
为了更好地了解中药、成分、疾病和相应靶标的相互作用关系，根据结果运用Cytoscape 3.8.0软件构建并绘制了中药-成分-疾病-途径-靶点的网络图。Y5m知览论文网 Y5m知览论文网
2 结果Y5m知览论文网
2.1 虎骨成分靶点信息查询Y5m知览论文网
以“虎骨”为搜索词在文献中搜索，通过Pubchem数据库获得虎骨19种氨基酸成分的SMILE号，并利用swisstargets数据库进一步获得了这19个化合物的预测靶点。经汇总删重后总共获得335个化合物靶点。Y5m知览论文网 Y5m知览论文网
2.2 疾病靶点的收集和筛选Y5m知览论文网
以“osteoporosis”为关键词，在GeneCards和NCBI数据库中检索人类基因。通过检索，将Genecards和NCBI两个数据库中的基因合并并删除重复基因，共得到4280个骨质疏松相关基因。把筛选得到的药物靶点和疾病靶点导入软件Venny 2.1，共得到168个共同靶点。Y5m知览论文网 Y5m知览论文网
2.3 PPI网络构建Y5m知览论文网
将药物和疾病共同靶点均输入String数据库，生物种类设置为“Homo sapiens”，构建PPI网络。该网络共有168个节点和1130条边，平均度值为13.5，见图1(图A 下载于string网站，图B 采用Cytoscape软件进行绘制)。Y5m知览论文网 Y5m知览论文网
2.4 拓扑分析Y5m知览论文网
拓扑分析通过度排序选择得分大于平均分值的基因作为关键目标。共选定66个关键目标。前20个目标用R3.6.3绘制，横坐标为每个目标的度值，见图2。从图中可知，APP、CXCL8、EGFR、PTGS2可能为虎骨治疗骨质疏松症的主要靶点。Y5m知览论文网 Y5m知览论文网
2.5 GO分析与KEGG通路分析Y5m知览论文网
将药物和疾病共有靶点进行GO的分子功能(MF)、细胞成分(CC)、生物过程(BP)富集和KEGG通道的分析，并引用String数据库，筛选修正P值≤0.05的项目，共富集得到1259条生物过程，147个与分子功能、80个与细胞组分相关以及26个信号通路。生物过程主要有神经递质的调节、对类固醇激素的反应、G-蛋白偶联受体信号通路。细胞组分主要有膜筏，膜微区，膜区。分子功能主要内肽酶激活、羧酸结合、有机酸结合。信号通路主要是神经配体受体相互作用通路和钙离子信号通路，见图3。Y5m知览论文网 Y5m知览论文网
2.6 分子对接验证结果Y5m知览论文网
选取虎骨的 8 个特征性成分作为配体，以虎骨靶点 PPI 网络中度值排序前四的靶蛋白作为受体，将两者对接，然后将结果绘制到热图中，见图4。从热图可以看出，大多数活性组分均与PTGS2具有结合活性。具有最高对接分数的化合物得分，见表1，其中得分最高的两组对接模式图，见图5。Y5m知览论文网 Y5m知览论文网
2.7 中药-成分-疾病-通路-靶点网络图的构建Y5m知览论文网
在以上分析结果的基础上，将中药-成分-疾病-路径-靶点信息导入Cytoscape 3.8.0中，绘制网络图，见图6。从网络图中可以看出，虎骨中的多种氨基酸成分通过多种通路对骨质疏松症的靶点进行作用，体现了虎骨治疗骨质疏松症的多成分-多途径-多靶点的作用机制。Y5m知览论文网 Y5m知览论文网
3 讨论Y5m知览论文网
虎骨有着非常悠久的药用史，起源于《名医别录》，历代医书，如唐代新修本草、宋代本草衍义、明代本草纲目、清代的配本草等，都有详细的虎骨记载。传统中医中认为虎骨性辛，微热。具有祛风、止痛、强筋骨、安神、止痢、解骨痹之功效。适用于风湿性关节痛、肌肉骨骼挛缩、屈伸不良、腰膝无力、四肢麻木、惊厥癫痫、长期痢疾肛门脱垂、恶性溃疡等[7,8]。Y5m知览论文网 Y5m知览论文网
根据分子对接的结果，推测PTGS2和EGFR可能为虎骨抗骨质疏松的作用靶点。核心靶点PTGS2可限制M-CSF以及RANKL的表达，进而影响成骨细胞/破骨细胞分化。同时PTGS2/COX2是潜在的花生四烯酸代谢调节产物，与疼痛密切相关[9]，这可能与虎骨的镇痛作用有关。骨结构完整性地维持依赖于骨祖细胞池中成骨细胞的持续更新。这一生物过程受到许多生长因子的精细调控。CHEN H等[10]发现，成骨细胞分泌的前列腺素E2(PGE2)通过抑制中枢神经系统的交感神经活动和激活感觉神经中的PGE2受体4(EP4)来调节骨形成。PGE2调节感觉神经来控制骨稳态和促进再生。表皮生长因子受体(EGFR)配体是已知的骨祖细胞有丝分裂原[11]。有体内外实验[12]表明，EGFR信号对骨内成骨细胞的存活至关重要。EGFR/ERK/EZH2信号的下调水平可能有助于骨原细胞衰老和皮质骨的年龄相关变性。抑制EGFR信号通过ERK1/2途径抑制细胞衰老诱导基因抑制因子Zeste同源物2(Ezh2)的增强子的表达，从而促进骨原细胞的衰老。下调EGFR信号传导具有生理意义。各种氨基酸则是各种酶的组成成分，其在骨质疏松症的发生发展中起着十分重要的作用。例如酪氨酸[13]、苯丙氨酸[14]、精氨酸[15,16]、亮氨酸[17]。尿羟脯氨酸[18,19,20]是体内胶原蛋白代谢的生化标志物，与骨吸收呈正相关。因此，分子对接结果和前人研究成果均验证了预测关键节点的可靠性。Y5m知览论文网 Y5m知览论文网
GO富集主要有神经递质的调节、对类固醇激素的反应、G-蛋白偶联受体，这三者均与PTGS2和EGFR有关。KEGG富集结果主要是神经配体受体相互作用信号通路和钙信号通路，两种通路均与疼痛[21,22]以及骨分化[23,24]有关。钙信号通路是调节骨稳态的经典通路，其与关键靶基因相互之间存在着复杂的协同/抑制作用。受损的钙信号传导可能导致骨骼对负荷的合成代谢反应降低，从而为患者带来骨质疏松症的风险[25]。Y5m知览论文网 Y5m知览论文网
因此，虎骨治疗骨质疏松症的分子机制很可能是多种氨基酸组分通过PTGS2、EGFR等靶点实现的。研究结果为虎骨治疗骨质疏松症的有效成分和治疗靶点的后续研究奠定了一定的基础，同时也为其临床应用提供了的理论依据和参考。Y5m知览论文网 Y5m知览论文网
参考文献Y5m知览论文网
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