Identification of chemical constituents in Lotion Fructus Cnidii Composita by UPLC-Q-GSq知览论文网
TOF-MS/MS .
CHENG Xiaohong JIANG Li DONG Xingting KANG Xiulin LIU LifangGSq知览论文网
Hospital for Skin Diseases, Chinese Academy of Medical Sciences Department ofGSq知览论文网
Pharmacognosy, School of Traditional Chinese Pharmacy, China Pharmaceutical University
GSq知览论文网 GSq知览论文网 Abstract：GSq知览论文网
Lotion Fructus Cnidii Composita is a common hospital preparation made from clinical prescriptions. Its clinical efficacy is accurate, but its pharmacodynamic material basis has not been clarified, an ultra-high performance liquid chromatography with quadrupole time-of-flight mass spectrometry (UPLC-QTOF-MS/MS) technique was developed to identify the chemical constituents of Lotion Fructus Cnidii Composita. The chemical constituents of Lotion Fructus Cnidii Composita were scanned by electrospray ionization (ESI) source in positive and negative ion modes. As a result, a total of 118 compounds were identified, including 45 alkaloids, 21 coumarins and chromones, 19 flavonoids, 14 saponins, 10 anthraquinones and 9 organic acids were tentatively identified and characterized via reference standards and by comparing mass spectrometry data with literature. As a result, UPLC-QTOF-MS/MS technology can quickly and sensitively identify the chemical components of Lotion Fructus Cnidii Composita, which provides a useful reference for exploring the pharmacodynamic material basis and further quality control study of the preparation.GSq知览论文网 GSq知览论文网
Keyword：GSq知览论文网
Lotion Fructus Cnidii Composita; UPLC-Q-TOF-MS/MS; chemical constituents; effective substances;GSq知览论文网 GSq知览论文网
复方蛇床子洗剂是由本院临床经验方制成的院内制剂，该方由蛇床子、苦参、地肤子、百部、蒲公英、熟大黄、黄柏、明矾等组成，具有燥湿、止痒、杀虫等功效[1]。临床上主要用于外阴、肛门瘙痒，阴道炎症，念珠菌感染及脚部湿疹，脚癣等的治疗且疗效确切，在本院的每年用药就达4万瓶。虽然以蛇床子为君药制成的复方外用洗剂已有多个品种上市，但目前的研究多集中于对其初步的药效学及单个活性成分的定量分析[2]，尚缺乏对该类制剂药效物质基础的系统研究。阐明复方中的化学成分组成是从整体上把握中药复方药效物质基础，建立基于临床价值导向的质量控制标准的关键所在。由于中药复方所含化学成分复杂，其结构各异且各类化合物的含量差异较大，给中药复方制剂的化学成分全面表征和质量控制带来了极大的难度。近年来，超高效液相色谱-飞行时间质谱联用技术（UPLC-Q-TOF-MS/MS）因具有高分辨、高灵敏度和高通量的特征，已成为表征中药复杂体系所含化学成分的重要手段[3]。因此，本文将采用该技术对复方蛇床子洗剂中的化学成分进行全面、系统的分析，为进一步阐明该制剂的药效物质基础和完善该制剂质量控制体系提供科学依据。GSq知览论文网 GSq知览论文网
1 材 料GSq知览论文网
1.1试 药GSq知览论文网
UHPLC-QTOF-MS分析对照品：氧化苦参碱、氧化槐果碱、槐果碱、槐定碱、花椒毒素、花椒毒醇、蛇床子素、欧前胡素、异虎耳草素、佛手柑内酯、地肤子皂苷Ic、山柰酚、木犀草苷、木犀草素、菊苣酸、绿原酸、隐绿原酸、新绿原酸、木犀草素、大黄酸、大黄素、芦荟大黄素、芦丁、槲皮素、咖啡酸、齐墩果酸、小檗碱、黄柏碱、巴马汀，以上对照品均购自成都埃法生物公司，质量分数≥98%。乙腈、甲醇（色谱纯，德国Merck公司）；甲酸（色谱纯，美国Sigma公司）。GSq知览论文网 GSq知览论文网
样品制备所用原料药材，蛇床子（批号：2101005）、苦参（批号：1912003）、地肤子（批号：2009021）、蒲公英（批号：2007012）、大黄（批号：2104007）、黄柏（批号：2111020）、百部（批号：2202001）均购自甘肃华庆堂药业饮片有限公司，明矾（批号：201023）购自江苏华洪药业科技有限公司，经第一作者鉴定，分别为伞形科植物蛇床Cnidium monnieri（L.）Cuss.的干燥成熟果实，豆科植物苦参Sophora flavescens Ait.的干燥根，藜科植物地肤Kochia scoparia（L.）Schrad.的干燥成熟果实，菊科植物蒲公英Taraxacum mongolicum Hand. -Mazz.的干燥全草，蓼科植物掌叶大黄Rheum palmatum L.的干燥根和根茎，芸香科植物黄皮树Phellodendron chinense Schneid.的干燥树皮，百部科植物直立百部Stemona sessilifolia（Miq.）Miq.的干燥块根，且符合《中国药典》规定。复方蛇床子洗剂（批号：20220104，由中国医学科学院皮肤病医院制剂室制备且符合江苏省食品药品监督管理局医疗机构制剂标准的规定）。GSq知览论文网 GSq知览论文网
1.2仪 器GSq知览论文网
SYNAPTG2-SQ-TOF质谱仪（美国Waters公司）；ACQUITY UPLC色谱仪（配有在线脱气机、柱温箱、高性能自动进样器和二极管阵列检测器）；Empower3.0工作站（美国Waters公司）；MasslynxV4.1分析软件（美国Waters公司）；H1650R高速冷冻离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司）、旋转蒸发仪RE52CS-1（上海亚荣生化仪器厂）、数显恒温水浴锅HH-4（常州国华仪器制造有限公司）、予华牌循环水真空泵SHZ-DⅢ、TD5001C电子天平（天津天马衡基有限公司）、万分之一电子天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）。GSq知览论文网 GSq知览论文网
2方 法GSq知览论文网
2.1 供试液的制备GSq知览论文网
2.1.1 对照品溶液的制备GSq知览论文网
取对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 毫升含1 μg的溶液，即得。GSq知览论文网 GSq知览论文网
2.1.2 复方蛇床子洗剂供试液的制备GSq知览论文网
取复方蛇床子洗剂25 mL，蒸干，残渣加甲醇使溶解，离心（12000 r/min，10 min）取上清液，过0.22 μm滤膜，即得。GSq知览论文网 GSq知览论文网
2.1.3 各单味药供试品溶液的制备GSq知览论文网
分别称取复方中各味药材适量，加入8倍量水煎煮1.5 h，连续煎煮3次，合并煎液，浓缩，取浓缩液25 mL，蒸干，残渣加甲醇25 mL使溶解，离心（12000 r/min，10 min）取上清液，过0.22 μm滤膜，即得。GSq知览论文网 GSq知览论文网
2.2 色谱和质谱条件GSq知览论文网
2.2.1色谱条件GSq知览论文网
采用Acquity HSS T3色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；Acquity BEH C18保护柱（5 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相为0.1%甲酸水（A）-0.1%甲酸乙腈（B）；梯度洗脱0~1 min，5%B；1~8 min，5%~40%B；8~10 min，40%~95%B；10~12 min，95%~95%B；12~13 min，95%~5%B；13 ~15 min，5%B；柱温40 ℃；流速0.4 mL/min；进样量1 μL。GSq知览论文网 GSq知览论文网
2.2.2 质谱条件GSq知览论文网
SYNAPTG2-SQ-TOF质谱仪（美国Waters公司），采用ESI离子源，正负离子模式下进行检测。数据采集形式为MSE Centroid；碰撞电压为25~50 eV；毛细管电压2500 V；锥孔电压45 V；去溶剂温度为250 ℃；使用高纯Ｎ2作为辅助喷雾电离与去溶剂气体，去溶剂气流速为800 L/h；锥孔气流为50 L/h；TOF MASSES(DA): Min=50.00000，Max=1200.000。GSq知览论文网 GSq知览论文网
3 结 果GSq知览论文网
采用UPLC-QTOF-MS/MS技术对复方蛇床子洗剂中所含化学成分进行全面分析，综合考虑保留时间（tR）、分子式、精确分子质量（m/z）、特征离子碎片以及参考相关文献，结合各单味药材谱峰进行成分归属分析。从该复方中共鉴定出118种化合物，包括45种生物碱、21种香豆素及色原酮类、19种黄酮及其苷类、14种皂苷类和10种蒽醌、9种有机酸类化合物。其中，22个来源于苦参，21个来源于蛇床子，21个来源于百部，21个来源于地肤子，17个来源于蒲公英，11个来源于大黄，9个来源于黄柏。复方提取物在正负离子模式下的BPI图（图1-A和图1-B）以及对照品、对应药材中这些成分提取离子流图（图1-C和图1-D）如图1。GSq知览论文网 GSq知览论文网
3.1生物碱类化合物GSq知览论文网
复方蛇床子洗剂生物碱类化合物较多，主要来源于苦参、百部和黄柏药材。本实验在苦参中鉴定出18种生物碱，生物碱类是苦参抑菌作用的主要活性成分之一[4]。苦参中生物碱多为喹诺里西啶类，少数为哌啶类和甾体类，按照骨架可分为苦参碱型（matrines）、金雀花碱型（cytisines）臭豆碱型（anagyrines）、羽扇豆碱型（lupinines）、1，4-氮杂茚满型（1，4-diazaindans）等类型[5]（图2）。其中苦参碱型是苦参生物碱的主要类型，苦参碱型生物碱在碰撞过程中易丢失中性片段H2O（18 D）、C5H7NO（97 D）和C5H9NO（99 D），形成m/z 150和m/z 148、m/z 136的特征片段[6]。根据苦参生物碱特征离子碎片，其中经过对照品比对鉴定出化合物4、5、7、10、12分别为苦参碱、槐果碱、槐定碱、氧化槐果碱和氧化苦参碱，再结合文献[7-8]推测化合物15、16、18、19、20分别为7,11-dehydromatrine、N-butylcytisine、oxylupanine、5-hydroxylupanine或7-hydroxylupanine。GSq知览论文网 GSq知览论文网
百部生物碱类型较多，不同类型生物碱的共同特征是具有共同的基本母核, 既氮杂奥环结构, 根据A、B环的不同连接方式可分为侧链一侧连接B环C-9位,另一侧连接C-8的原百部碱型（Protostemonine-type）；连接在C-9位成γ-内酯环的金刚大碱型（Croomine-type）；接在C-9a位的狭叶百部碱型（Maistemonine-type）；连接在A环C-1位的对叶百部碱型（Tuberostemonine-type）；以及侧链与母核仅单链连接的细花百部碱型（Parvistemonine-type）[9]，百部生物碱型是该科植物特有的具吡咯或吡啶骈氮杂薁母核结构的生物碱，具有驱虫、杀虫和抗菌等作用[10]。本研究以金刚大碱（croomine）、百部新碱（stemoninine）、新对叶百部碱（neotuberostemonine）、狭叶百部碱（maistemonine）为例总结从百部中鉴定的生物碱质谱裂解规律（图3）。金刚大碱型特征是在C-9位的螺旋γ内酯，以金刚大碱为例，在[M+H]+准分子离子峰m/z 322.2018，母离子中七元环上H原子通过一个五元环转移到C-3处的α-甲基-γ-丁丙烯酸环，消除一个CH3CH=C(OH)2产生碎片在m/z 248，继续消除一个CH3CH=C(OH)2产生碎片m/z 174，或者丢失中性分子产生m/z 230[M+H-H2O]+、m/z 162[M+H-C4H2O2]+等碎片。百部新碱型生物碱以三环2H-呋喃[3,2-c]吡咯[1,2-α]-氮杂环为特征，以百部新碱为例，在[M+H]+准分子离子峰m/z 390.2270，首先母离子失去一分子H2O，产生碎片m/z 372，随后含氮七元环上的H通过四元过渡态转移到五元内酯环，消除中性片段CH3CH=C(OH)2产生碎片m/z 298[M+H-H2O-CH3CH=C(OH)2]+。对叶百部碱特征是C连接在9a位，以新对叶百部碱为例，首先母离子一个H原子转移到内酯环消除一分子CH3CH=C(OH)2产生m/z 302[M+H-CH3CH=C(OH)2]+，再继续消除一分子CH3CH=C(OH)2，形成碎片m/z 228[M+H-CH3CH=C(OH)2-CH3CH=C(OH)2]+。狭叶百部碱加和离子方式为[M+Na]+，分子离子峰为m/z 438.1900，在[M+H]+准分子离子丰度较低，首先母离子失去一分子H2O，产生碎片m/z 420[M+Na-H2O]+，或丢失128 D中性碎片产生m/z 310片段，再脱去一分子CO2，产生m/z 266碎片，二级碎片中未观察到丢失中性片段CH3CH=C(OH)2。GSq知览论文网 GSq知览论文网
综上，总结百部中生物碱裂解规律有以下特点：（1）分子离子峰以[M+H]+或[M+Na]+的加和形式存在；（2）裂解过程中由于百部生物碱中大部分存在五元内酯环，其七元环上的H可以通过四元过渡态转移到内酯环，消除中性片段CH3CH=C(OH)2（74 D），产生特征碎片离子[M+H-74]+；（3）百部生物碱结构中存在羟基等基团，质谱裂解过程中会发生CO、CO2和H2O等中性分子的竞争丢失[10]。GSq知览论文网 GSq知览论文网
化合物48、55、56准分子离子峰均在m/z 390，且碎片离子和百部新碱相似，推测化合物46、53、54为百部新碱同分异构体。化合物56、69具有相同的准分子离子峰和m/z 302、228特征碎片，是一组同分异构体且为对叶百部碱型，根据其保留时间推测化合物58、70分别为tuberostemonine H、tuberostemonine K，其碎片离子信息与文献报道一致[11]。GSq知览论文网 GSq知览论文网
研究表明[12]，黄柏中生物碱如小檗碱、巴马汀可以抑制革兰阴性菌及革兰阳性菌，有广谱抗菌作用。其裂解方式主要是去甲基、脱羰基、去亚甲基等，化合物81在[M]+准分子离子峰352.1553，主要碎片为m/z 336[M-CH3]+、m/z 322[M-CHO]+、m/z 308[M-CH3-H-CO]+，参照对照品，推测化合物81为巴马汀。同理，根据裂解规律和碎片离子信息，推测化合物29、33、34、38、50、82分别为木兰箭毒碱（magnocurarine）、黄柏碱（phellodendrine）、木兰花碱（magnoflorine）、异心莲碱（lotusine）、蝙蝠葛任碱（menisperine），小檗碱（berberine），与文献报道一致[13]。GSq知览论文网 GSq知览论文网
3.2香豆素及色原酮类GSq知览论文网
蛇床子作为复方中的君药，其活性成分为香豆素类，具有抗炎镇痛、抗菌杀虫止痒的作用[14]。本实验经过对照品比对，质谱信息，色谱保留时间，从复方蛇床子洗剂中共鉴定21个香豆素及色原酮类化合物。以蛇床子素为例，其质谱碎片信息及裂解途径如图4，在[M+H]+的准分子离子峰为m/z 245.1178，首先母离子发生苄基裂解脱去异丁烯基（C4H8，M=56）产生特征碎片离子m/z 189[M+H-C4H8]+，再发生甲氧基断裂并脱去吡喃环上1分子CO产生特征碎片离子m/z 161，再继续脱去CO产生碎片m/z 131。化合物68、72、77碎片中有[M+H-H2O]+，说明含有-OH取代基，结合相关文献[15]推测化合物72、74、78分别为phlojodicarpin、auraptenol、2'-hydrate-deoxymeranin。化合物87、91准分子离子峰m/z 243.1021[M+H]+(C15H14O3)，产生碎片m/z 241[M+H-H2]+，189等特征碎片，推测化合物87、91取代基中比蛇床子素多一个共轭双键，结合文献[11]，推测化合物87，91互为同分异构体(E/Z)7-methoxy-8-(3-methylbuta-1,3-dien-1-yl)-2H-chromen-3-one。蛇床子中另一类香豆素为呋喃香豆素，与简单香豆素类裂解规律相似，一般都是连续失去CO、OH、H2O、CH3或OCH3的碎片离子峰，特征碎片离子有m/z 189、133、174等。GSq知览论文网 GSq知览论文网
化合物96连续丢失两个-OCH3，说明C5和C8为取代基为-OCH3，推测化合物96为异虎耳草素（isopimpinellin）。同理推测化合物66、94分别为花椒毒醇（xanthotoxol）、佛手柑内酯（bergapten），其碎片信息与文献报道一致[16]。化合物51在[M+H]+准分子离子峰为275.0905，在m/z 189处有特征碎片离子，结合文献[13]推测化合物51为karenin，化合物105推测为karenin同分异构体。GSq知览论文网 GSq知览论文网
3.3黄酮类化合物GSq知览论文网
复方蛇床子洗剂中黄酮类化合物主要来源于蒲公英、苦参和地肤子，可分为黄酮苷和黄酮苷元。黄酮苷元容易发生C环C-C键的断裂，即RDA裂解，以及CO、CO2、CHO等一些中性分子丢失，在负离子模式下黄酮苷元RDA裂解会产生m/z 151碎片离子，可作为黄酮苷元的诊断离子，黄酮苷类质谱裂解过程经常发生糖苷键的断裂，产生162 D、146 D、176 D的中性丢失[17]。GSq知览论文网 GSq知览论文网
此外有部分黄酮类成分来源于苦参，目前，关于苦参中生物碱和黄酮类抑菌作用已多有报道[4]。苦参中黄酮类化合物特征碎片为m/z 261[C16H21O3]-、m/z 161[C9H5O3]-、m/z 177[C9H5O4]-、m/z 275[C17H23O3]-等。GSq知览论文网 GSq知览论文网
3.4有机酸类化合物GSq知览论文网
对比对照品、精确分子质量和质谱信息，鉴定了6个来源于蒲公英的有机酸类化合物，分别为菊苣酸、隐绿原酸、新绿原酸、绿原酸、咖啡酸和阿魏酸。该类化合物是蒲公英抗炎、抑菌的主要活性成分之一，其基本结构为酚羟基取代的芳香环、脂肪酸等，易在羰基处断裂形成碎片离子，以负离子模式下菊苣酸为例，准分子离子峰m/z 473.0720，首先母离子发生C-O断裂，得到m/z 311[M-H-C9H6O3]-碎片，再丢失一分子H2O，产生碎片m/z 311[M-H-C9H6O3-H2O]-，C-O键继续断裂，产生m/z 293、179碎片，质谱碎片信息及裂解途径如图5：GSq知览论文网 GSq知览论文网
3.5皂苷类化合物GSq知览论文网
复方蛇床子洗剂中的萜类化合物主要来源于地肤子，研究表明，地肤子中皂苷类是其抗搔痒、抗炎和抗过敏作用的主要有效成分[18]。本实验从地肤子中共鉴定出14个皂苷类化合物，主要为齐墩果酸型皂苷，以地肤子皂苷Ic为例，在[M-H]-准分子离子峰763.4269，二级碎片m/z 631、m/z 587、m/z 551、m/z 455，分别对应[M-H-Ara]-、[M-H-Ara-CO2]-、[M-H-Ara-CO2-2H2O]-、[M-H-Ara-CO2-Ara]-，得到的m/z 455碎片可以继续失去中性分子HCOOH、H2O、CO等以及RDA裂解产生碎片m/z 409、407、391、247、219，质谱碎片信息及裂解途径如图6。地肤子皂苷类容易得到丰度较大的分子离子峰[M-H]-，其裂解方式通常为C-3位上的糖苷键容易发生断裂[19]，随后其他取代位置上的基团断裂，最后都能得到稳定的苷元碎片离子齐墩果酸m/z 455.3532。因此碎片离子m/z 455可以作为该类化合物的特征离子。峰92在[M-H]-准分子离子峰为955.4907，对其进行MS/MS分析得到碎片m/z 793、631、455等，峰92连续丢失两分子葡萄糖基，并产生齐墩果酸型皂苷特征碎片m/z 455，说明化合物92中连接两分子葡萄糖基，其中一分子葡萄糖基连接在C-3位，参考文献[20]推测化合物92为2′-O-Glucopyranosyl-momordin Ic，同理推测化合物96、98分别为2′-O-β-D-Glucopyranosyl momordin IIc、Kochianoside II。根据特征碎片、糖苷键断裂产生的中性丢失再结合相关文献共推测出地肤子中14个皂苷类化合物。GSq知览论文网 GSq知览论文网
3.6蒽醌类化合物GSq知览论文网
复方中蒽醌类化合物主要来源于大黄，共鉴定出10个蒽醌类化合物，其中经过标准品比对，鉴定出化合物105、114、116分别为大黄酸、芦荟大黄素和大黄素。GSq知览论文网 GSq知览论文网
已推断出的化合物质谱信息见表1。GSq知览论文网 GSq知览论文网
4 讨 论GSq知览论文网
中医认为阴道炎症，念珠菌感染为湿热下注，湿热生虫所致，宜清热利湿，杀虫化浊。复方蛇床子洗剂以蛇床子味辛、苦，性温，有燥湿止痒、杀虫之功，为君药，蒲公英、苦参、地肤子清热燥湿、杀虫，大黄、黄柏清热解毒，此五味为臣药；明矾性寒，收敛杀虫，燥湿止痒，为佐药；百部杀虫止痒，为使药。诸药协同，共奏清热解毒、抗菌消炎、止痒止痛之功。长期的临床实践已证实该方对湿疹，尤其是外阴、阴囊、脚部湿疹，皮炎、念珠菌感染、阴道滴虫和炎症、皮肤瘙痒、脚癣等具有良好的治疗效果。本研究运用UPLC-Q-TOF-MS/MS技术对复方蛇床子洗剂中所含的化学成分进行了系统分析，并结合处方中单味药材谱峰信息确定了各化合物归属，最终共鉴定了118种化合物，其中有22个来源于苦参，21个来源于蛇床子，21个来源于百部，21个来源于地肤子，17个来源于蒲公英，11个来源于大黄，9个来源于黄柏。其中君药蛇床子中的主要有效成分有蛇床子素、花椒毒素等，具有广谱的抗菌特性，且蛇床子素是其中抗菌活性最强的单体，具有抑菌、抗病毒、抗炎的药理作用[14]；臣药地肤子中的皂苷类成分如地肤子皂苷Ic具有抗瘙痒、抗炎、抗过敏的药理作用[18]；苦参的生物碱如苦参碱则具有杀菌、抗炎、免疫抑制和抗过敏的作用[4]；蒲公英的有机酸类如菊苣酸具有显著的抗炎、抗病毒的药理作用[21]；黄柏中的黄柏碱、小檗碱，大黄中的多种蒽醌类化合物更是抗菌抗炎的代表性活性成分[12]；佐药明矾（主含 [KAl(SO4)2•12H2O]）是常用的攻毒杀虫止痒矿物药[22]；使药百部中所含的多种生物碱具有明显的驱虫、杀虫和抗菌的作用[10]；这些成分之间相互配合、相互作用共同发挥复方蛇床子洗剂“清热解毒、抗菌消炎、止痒止痛”的功效。后续对该制剂的质量标准提升研究中，建议按新颁布的《中药新药质量标准研究技术指导原则》要求针对这些主要活性成分进行定性定量分析方法研究，建立科学、合理的质量检测指标，真正反映复方蛇床子洗剂的整体质量。本文的实验结果为进一步深入阐明复方蛇床子洗剂通过多成分、多途径发挥临床疗效的科学内涵以及对该制剂质量控制水平的提高提供了重要参考。GSq知览论文网 GSq知览论文网
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